表皮角质形成细胞的迁移是创面愈合过程中皮肤再上皮化的基础。利用单层原代人表皮角质形成细胞进行体外划痕实验是评估其迁移能力的一种简单有效的方法。用机械划痕法直接破坏融合成单层的角质形成细胞，破坏细胞之间及其与底层基质之间的黏附，这类似于在体实验中皮肤的物理创伤。角质形成细胞将经历上皮到间充质的转变，并增强其向彼此迁移的能力，从而通过重组细胞-细胞和细胞-细胞外基质连接来弥补缺损。划痕实验可用于功效原料和产品的修复、再生、修护和愈合等宣称。然而，划痕试验看似简单，但稳定建立可重复的划痕方法是实验室操作的基本功。

人类表皮角质形成细胞(HEK)是一种非常特殊的细胞类型，其起源于基底层，经历快速分化、移行、角化并最终脱落。只有基底层或毛囊隆突部的干细胞保持高增殖潜能。原代人HEK和永生化的人表皮细胞系HaCaT在RNA表达谱上存在显著差异；差异主要在于调节细胞周期的基因不同。与HEK相比，HaCaT细胞的G1/S期与S期基因表达上调，负调控细胞进入S期的基因则表达下调。与细胞周期调控相关的转录因子的表达也存在差异，如淀粉样β前体蛋白结合家族B成员1(APBB1)、分离酶(ESPL1)、转录因子19(TCF19)和锌指蛋白300(ZNF300)。研究发现，由于细胞在较高传代次数下的分化和衰老，早期和晚期HEK细胞的转录组存在统计学意义的差异。例如，随着培养代次的增加，细胞变大，增殖速度变慢(图1B)，直到出现凋亡(图1C)。因此，实验室应该使用传代早期的NEK(图1A)，它们比晚期NEK更接近原始组织，而且与细胞系相比产生更具代表性和有意义的数据。

图1 培养中的原代HEK：(A)健康、增殖的原代HEK。(B)分化的原代HEK(>3代)。(C)凋亡的原代HEK。

    2、原代细胞分离

分离HEK是获得充足良好的原代细胞的关键一步。为了获得无成纤维细胞的EK培养，表皮和真皮的分离是必不可少的，应该由高效的裂解酶来完成这一步骤。这种酶能够温和地分解IV型胶原，而IV型胶原是基底膜致密层的主要蛋白质，在裂解酶的作用下表皮与真皮分离。之后再用第二种酶--胰蛋白酶破坏表皮细胞与细胞之间的相互作用，导致单个表皮细胞悬浮。使用角质形成细胞专用培养液可进一步诱导角质形成细胞的增殖，其他表皮细胞类型，如黑素细胞、免疫细胞(如朗格汉斯细胞)以及神经内分泌的默克尔细胞将丢失。

3、表皮修复原理

皮肤受损时需要修复表皮屏障。再上皮化是修复皮肤屏障的第一步，也是重建第一层角质形成细胞和防止感染的过程。在基底层，这一过程包括角质形成细胞从周围表皮动员、有丝分裂和迁移，随后是细胞分化和表皮屏障的完全修复。创伤发生后，细胞接触抑制消失，导致紧邻伤口边缘的角质形成细胞迁移。上皮-间充质转化(EMT)的这一过程使得与基底膜接触的上皮细胞通过激活与增强的迁移能力、侵袭性、抗凋亡和产生细胞外基质(ECM)蛋白相关的生化变化而获得间充质细胞表型。人体有三种类型的EMT：第一种发生在发育过程中，第二种发生在伤口愈合过程中作为作为修复过程的一部分，第三种发生在癌症和转移期间。

在第二种EMT中，桥粒下调(E-钙粘附素下调)使角质形成细胞迁移，同时表达新的纤维连接蛋白识别整合素(例如，α5β1和αvβ6)。特定细胞角蛋白的表达发生改变；特定角蛋白(K16和K17)与间充质细胞标记物vientin一起上调。促进EMT转变的特定转录因子SNAI1、Slug、ZEB1、ZEB2和twist在EMT诱导后都在EK中上调。创伤愈合中的EMT与炎症有关；一旦炎症被消除，伤口部位再次被角质形成细胞覆盖，通过激活GRHL2、OVOL1和Ovol2转录因子，就会发生反向间充质-上皮转化(MET)。

4、体外方法的优点

表皮迁移可以在体外使用原代HEK进行研究。划痕实验是最有效的模拟体外再上皮化的技术。融合单层的原代角质形成细胞经历机械划伤后，残留的细胞开始迁移以恢复单层。原代HEK能够很好地模拟在体伤口愈合过程中表皮细胞的迁移，特别是在细胞-基质和上皮细胞的细胞-细胞相互作用方面。但是，强烈建议使用划痕工具进行方法的标准化。

【实验流程】

划痕实验基本步骤包括在细胞单层中创建一个“伤口”，在细胞迁移开始和迁移过程中定期捕获图像以闭合伤口，通过比较图像或标记细胞以确定细胞迁移速率、面积和标志物变化，通过基因和蛋白的分析探讨迁移机制。其简要流程如下（具体方案可咨询新葡萄新京8883公司）：

  1、人体皮肤组织处理及原代分离HEK

  2、原代HEK培养

  3、划痕愈合试验

  4、形态观察、标志物检测、基因和蛋白组分析

  5、数据分析和解释

图2、可在12孔板底背面划线对于确保观察和拍照时准确定位坐标非常必要，插入式划痕器可使方法标准化

图3、划痕后不同时段(0、12和20小时)原代HEK迁移。

  1、可用商品化或自制刮刀进行机械损伤操作，也可以使用塑料吸尖，但都不够标准，建议使用划痕专用培养皿。普通划痕和标准化（插入式）划痕的区别如下：

  2、人的HEK在体外很容易分化。为保持其增殖潜力，在培养时需细心观察。建议每隔两天更换一次培养基，以免细胞生长超过80%。

  3、EDTA可破坏细胞与细胞的附着，但不会破坏细胞与培养板的附着。EDTA的使用将缩短胰酶作用的时间。

  4、细胞增殖和细胞迁移是细胞的两种不同行为。去除细胞培养上清液中的EGF和BPE可降低原代HEK细胞增殖能力。更普遍的作法是使用DNA交联剂丝裂霉素C来抑制增殖（注意使用浓度）。

  5、使用qRT-PCR进行基因表达研究，可以量化EMT和迁移标志物的表达变化，如波形蛋白、角蛋白16或17(KRT16或KRT17)和ZeB，其在HEK迁移过程中上调。如果需要蛋白质分布分析，可以将细胞培养在小室载玻片或盖玻片中，并用免疫细胞化学(ICC)定位分子标记。

  6、使用测量软件可以量化迁移过程。应注意细胞在塑料表面上的迁移不是在一维方向上移动，而是在二维方向上移动，因此建议计算迁移面积以获得更准确和更有意义的结果。

  7、不同供体皮肤的原代HNK细胞变异性可能很高。图4显示三个不同女性面部皮肤提取的原代HEK细胞，可以看到45%的变异性。当来自多个供体的HNK数据结合在一起时，应充分考虑年龄、性别和不同解剖区域的差异的干扰作用。解决办法是显示每个供体的单独数据或必须执行标准化；为了数据归一，将所有处理组的迁移划分为未处理组在每个供体细胞内的迁移；然后对不同的供体细胞进行平均值和统计分析。

图4、来自不同供体原代HEK的迁移差异

    看似简单的划痕试验，背后还有许多问题需要探讨：什么是自由式迁移？表皮-间质转换究竟有什么机制？增殖、迁移和侵袭有什么区别？迁移是怎么进行的？且听下回道来。

【参考文献】

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